層析技術的應用與發展，對于植物各類化學成分的分離鑒定工作起到重大的推動作用。如中藥丹參的化學成分在30年代僅從中分離到3種脂溶性色素，分別稱為丹參酮Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。但以后進一步的研究，發現除丹參酮Ⅰ為純品外，Ⅱ、Ⅲ、均為混合結晶。此后通過各種層析方法，迄今已發現15種單體（其中有4種為我國發現）。新的層析技術不斷發展，隨著層析理論和電子學、光學、計算機等技術的應用，層析技術已日趨完善。
一、層析法的基本原理： 層析過程是基于樣品組分在互不相溶的兩“相"溶劑之間的分配系數之差（分配層析），組分對吸附劑吸附能力不同（吸附層析），和寓子交換，分子的大?。ㄅ抛鑼游觯┒蛛x。通常又將一般的以流動相為氣體的稱為氣相層析，流動相為液體的稱為液相層析。
一、吸附層析法（AdsorptionChromatography）
?。ㄒ唬┪絼⑷軇┡c被分離物性質的關系：液一固吸附層析是運用較多的方法，特別適用于很多中等分子量的樣品（分子量小于1，000的低揮發性樣品）的分離，尤其是脂溶性成分一一般不適用于高分子量樣品如蛋白質、多糖或離子型親水住化合物等的分離。吸附層析的分離效果，決定于吸附劑、溶劑和被分離化合物的性質三因素。
1. 吸附劑：常用的吸附劑有硅膠、氧化鋁、活性炭、硅酸鎂、聚酰胺、硅藻土等。
（1） 硅膠：層析用硅膠為一多孔性物質，分子中具有硅氧烷的交鏈結構，同時在顆
粒表面又有很多硅醇基。硅膠吸附作用的強弱與硅醇基的含量多少有關。硅醇基能夠通過氫鍵的形成而吸附水分，因此硅膠的吸附力隨吸著的水分增加而降低。若吸水量超過17％，吸附力極弱不能用作為吸附劑，但可作為分配層析中的支持劑。對硅膠的活化，當硅膠加熱至100～110℃時，硅膠表面因氫鍵所吸附的水分即能被除去。當溫度升高至500℃時，硅膠表面的硅醇基也能脫水縮臺轉變為硅氧烷鍵，從而喪失了因氫鍵吸附水分的活往，就不再有吸附劑的性質，雖用水處理亦不能恢復其吸附活性。所以硅膠的活化不宜在較高溫度進行（一般在170cC以上即有少量結合水失去）。
硅膠是一種酸性吸附劑，適用于中性或酸性成分的層析。同時硅膠又是一種弱酸性陽離子交換劑，其表面上的硅醇基能釋放弱酸性的氫離子，當遇到較強的堿注化臺物，則可因離子交換反應而吸附堿性化合物。
?。?）氧化鋁：氧化鋁可能帶有堿性（因其中可混有碳酸鈉等成分），對于分離一些堿性中草藥成分，如生物堿類的分離頗為理想。但是堿性氧化鋁不宜用于醛、酮、醋、內酯等類型的化合物分離。因為有時堿性氧化鋁可與上述成分發生次級反應，如異構化、氧化、消除反應等。除去氧化鋁中絢堿性雜質可用水洗至中性，稱為中性氧化鋁。中性氧化鋁仍屬于堿性吸附劑的范疇，本適用于酸性成分的分離。用稀硝酸或稀鹽酸處理氧化鋁，不僅可中和氧化鋁中含有的堿性雜質，并可使氧化鋁顆粒表面帶有NO3一或CI一的陰離子，從而具有離于交換劑的性質，適合于酸性成分的層析，這種氧化鋁稱為酸性氧化鋁。供層析用的氧化鋁，用于拄層析的，其粒度要求在100～160目之間。粒度大子100目，分離效果差：小于160目，溶濃流速大慢，易使譜帶擴散。樣品與氧化鋁的用量比，一般在1：20～50之間層析柱的內徑與柱長比例在1：10-20之向。
在用溶劑沖洗柱時，流速不宜過快，洗脫液的流速一般以每半～1小時內流出液體的毫升數與所用吸附劑的重量（克）相等為合適。
（3）活性炭：是使用較多的一種非極性吸附劑。一般需要先用稀鹽酸洗滌，其次用乙醇洗，再以水洗凈，于80℃干燥后即可供層析用。層析用的活性炭，選用顆粒活注炭，若為活性炭細粉，則需加入適量硅藻土作為助濾劑一并裝柱，以免流速太慢。活性炭主要且于分離水溶性成分，如氨基酸、糖類及某些甙?；钚蕴康挠袨槲阶饔?，在水溶液中zui強，在有機溶劑中則較低弱。故水的洗脫能力zui弱，而有機溶劑則較強。例如以醇-水進行洗脫時，則隨乙醇濃度的遞增而洗脫力增加?；钚蕴繉Ψ枷阕寤衔锏奈搅Υ笥谥咀寤衔?，對大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。利用這些吸附性的差別，可將水溶性芳香族物質與脂肪族物質分開，單糖與多糖分開，氨基酸與多肽分開。
2.溶劑：層析過程中溶劑的選擇，對組分分離關系極大。在柱層析時所用的溶劑（單一劑或混合溶劑）習慣上稱洗脫劑，用于薄層或紙層析時常稱展開劑。洗脫劑的選擇，須根據被分離物質與所選用的吸附劑性質這兩者結合起來加以考慮在用極性吸附劑進行層析時，當被分離物質為弱極性物質，一般選用弱極性溶劑為洗脫劑；被分離物質為強極性成分，則須選用極性溶劑為洗脫劑。如果對某一極性物質用吸附性較弱的吸附劑（如以硅藻土或滑石粉代替硅膠），則洗脫劑的極性亦須相應降低。
在柱層操作時，被分離樣品在加樣時可采用于法，亦可選一適宜的溶劑將樣品溶解后加入。溶解樣品的溶劑應選擇極性較小的，以便被分離的成分可以被吸附。然后漸增大溶劑的極性。這種極性的增大是一個十分緩慢的過程，稱為“梯度洗脫"，使吸附在層析柱上的各個成分逐個被洗脫。如果極性增大過訣（梯度太大），就不能獲得滿意的分離。溶劑的洗脫能力，有時可以用溶劑的介電常數（ε）來表示。介電常數高，洗脫能力就大。以上的洗脫順序僅適用于極性吸附劑，如硅膠、氧化鋁。對非極性吸附劑，如活性炭，則正好與上述順序相反，在水或親水住溶劑中所形成的吸附作用，較在脂溶性溶劑中為強。
3.被分離物質的性質：被分離的物質與吸附劑，洗脫劑共同構成吸附層析中的三個要素，彼此緊密相連。在的吸附劑與洗脫劑的條件下，各個成分的分離情況，直接與被分離物質的結構與性質有關。對極性吸附劑而言，成分的極性大，吸附住強。
當然，中草藥成分的整體分子觀是重要的，例如極性基團的數目愈多，被吸附的住能就會大些，在同系物中碳原子數目少些，被吸附也會強些?？傊?，只要兩個成分在結構上存在差別，就有可能分離，關鍵在于條件的選擇。要根據被分離物質的性質，吸附劑的吸附強度，與溶劑的性質這三者的相互關系來考慮。首先要考慮被分離物質的極性。如被分離物質極性很小為不含氧的萜烯，或雖含氧但非極性基團，則需選用吸附性較強的吸附劑，并用弱極性溶劑如石油醚或苯進行洗脫。但多數中藥成分的極性較大，則需要選擇吸附性能較弱的吸附劑（一般Ⅲ～Ⅳ級）。采用的洗脫劑極性應由小到大按某一梯度遞增，或可應用薄層層析以判斷被分離物在某種溶劑系統中的分離情況。此外，能否獲得滿意的分離，還與選擇的溶劑梯度有很大關系?，F以實例說明吸附層析中吸附劑、洗脫劑與樣品極性之間的關系。如有多組分的混合物，象植物油脂系由烷烴、烯烴、舀醇酯類、甘油三酸醋和脂肪酸等組份。當以硅膠為吸附劑時，使油脂被吸附后選用一系列混合溶劑進行洗脫，油脂中各單一成分即可按其極性大小的不同依次被洗脫。
又如對于C-27甾體皂甙元類成分，能因其分字中羥基數目的多少而獲得分離：將混合皂甙元溶于含有5％氯仿的苯中，加于氧化鋁的吸附柱上，采用以下的溶劑進行梯度洗脫。如改用吸附性較弱的硅酸鎂以替代氧化鋁，由于硅酸鎂的吸附性較弱，洗脫劑的極牲需相應降低，亦即采用苯或含5％氯仿的苯，即可將一元羥基皂甙元從吸附劑上洗脫下來。這一例子說明，同樣的中草藥成分在不同的吸附劑中層析時，需用不同的溶劑才能達到相同的分離效果，從而說明吸附劑、溶劑和欲分離成分三者的相互關系。
?。ǘ┎緦訉游觯罕訉游鍪且环N簡便、快速、微量的層析方法。一般將柱層析用的吸附劑撒布到平面如玻璃片上，形成一薄層進行層析時一即稱薄層層析。其原理與柱層析基本相似。
1.薄層層析的特點：薄層層析在應用與操作方面的特點與柱層析的比較。
2.吸附劑的選擇：薄層層析用的吸附劑與其選擇原則和柱層析相同。主要區別在于薄層層析要求吸附劑（支持劑）的粒度更細，一般應小于250目，并要求粒度均勻。用于薄層層析的吸附劑或預制薄層一般活度不宜過高，以Ⅱ～Ⅲ級為宜。而展開距離則隨薄層的粒度粗細而定，薄層粒度越細，展開距離相應縮短，一般不超過10厘米，否則可引起色譜擴散影響分離效果。
3.展開劑的選擇：薄層層析，當吸附劑活度為一定值時（如Ⅱ或Ⅲ級），對多組分的樣品能否獲得滿意的分離，決定于展開劑的選擇。中草藥化學成分在脂溶性成分中，大致可按其極性不同而無極性、弱極性、中極性與強極性。但在實際工作中，經常需要利用溶劑的極性大小，對展開劑的極性予以調整。 4·特殊薄層：針對某些性質特殊的化合物的分離與檢出，有時需采用一些特殊薄層。
?、?熒光薄層：有些化合物本身無色，在紫外燈下也不顯熒光，又無適當的顯色劑時，則可在吸附劑中加入熒光物質制成熒光薄層進行層析。展層后置于紫外光下照射，薄層板本身顯熒光，而樣品斑點處不顯熒光，即可檢出樣品的層析位置。常用的熒光物質多為無機物。其一是在 254nm紫外光激發下顯出熒光的，如錳激潔的硅酸鋅。另一種為在365nm紫外光激發下發出熒光的，如銀激化的硫化鋅硫化鎬。
?、?絡合薄層：常用的有硝酸銀薄層，用來分離碳原子數相等而其中C一C雙鍵數目不等的一系列化合物，如不飽和醇、酸等。其主要機理是由于C一C鍵能與硝酸銀形成絡合物，而飽和的C一C鍵則不與硝酸銀絡合。因此在硝酸銀薄層上，化臺物可由于飽和程度不同而獲得分離。層析時飽和化合物由于吸附zui弱而Rfzui高，含一個雙鍵的較含兩個雙鍵的Rf值高，含一個三鍵的較含一個雙鍵的Rf值高。此外，在一個雙鍵化臺物中，順式的與硝酸銀絡合較反式的易于進行。因此，還可用來分離順反異構體。
③ 酸堿薄層和PH緩沖薄層：為了改變吸附劑原來的酸堿性，可在鋪制薄層時采用稀酸或稀堿以代替水調制薄層。例如硅膠帶微酸性，有時對堿性物質如生物堿的分離不好，如不能展層或拖尾，則可在鋪薄層時，用稀堿溶液0.1～0.5NNa0H溶液制成堿性硅膠薄層。例如豬屎豆堿在以硅膠為吸附劑時，以氯仿-丙酮一甲醇（8：2：1）為展開劑Rf＜0.1，采用堿性硅膠薄層用上述相同展開劑，Rf值增至0.4左右。說明豬屎豆堿為——堿性生物堿。 5.應用：薄層層析法在中草藥化學成分的研究中，主要應用于化學成分的預試、化學成分的鑒定及探索柱層分離的條件。
用薄層層析法進行中草藥化學成分預試，可依據各類成分性質及熟知的條件，有針對性地進行。由于在薄層上展層后，可將一些雜質分離，選擇性高，可使預試結果更為可靠。
以薄層層析法進中草藥化學成分鑒定，要有標準樣品進行共薄層層析。如用數種溶劑展層后，標準品和鑒定品的Rf值、斑點形狀顏色都*相同，則可作初步結論是同一化合物。但一般需進行化學反應或紅外光譜等一種儀器分析方法加以核對。
用薄層層析法探索柱層分離條件，是實驗室的常規方法。在進行柱層分離時，首先考慮選用何種吸附劑與洗脫劑。在洗脫過程中各個成分將按何種順序被洗脫，每一洗脫液中是否為單一成分或混合體，均可由薄層的分離得到判斷與檢驗。通過薄層的預分離，還可以了解多組分樣品的組成與相對含量。如在薄層上摸索到比較滿意的分離條件，即可將此條件用于干柱層析。但亦可以將薄層分離條件經適當改變，轉至一般往層所采用洗脫的方式進行制備柱分離。利用薄層的預分離尋找柱層的洗脫條件時，假定在薄層上所測得的Rf值一樣品在柱層中的比移率（R）。這是由于在薄層展開時，薄層固定相中所含的溶劑經過不斷的蒸發，而使薄層上各點位置所含的溶劑量是不等的，靠近起始線的含量高于薄層的前沿部分。但若嚴格控制層析操作條件，則可得到接近真實的Rf值。用薄層進行某一組分的分離，其Rf值范圍，一般情形下為0.85＞Rf＞0.05.此外，薄層層析法亦應用于中草藥品種、藥材及其制劑真偽的檢查、質量控制和資源調查，對控制化學反應的進程，反應副產品產物的檢查，中間體分析，化學藥品及制劑雜質的檢查，臨床和生化檢驗以及毒物分析等，都是有效的手段。
